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神經調節(jié)素受體降解蛋白(Nrdpl)在老年大鼠體外循環(huán)導致的術后認知功能障礙中的作用及機制研究
摘要
目的：通過建立老年大鼠體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB) 導致的術后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunctions，POCD)
模型，初步探討老年大鼠CPB后POCD及海馬神經元凋亡與神經調節(jié) 素受體降解蛋白(Nrdpl)的相關性。通過慢病毒構建空載質粒、Nrdpl 過表達及沉默海馬神經元細胞，探討Nrdpl在缺氧復氧模型中對神經 元細胞凋亡的調控作用；并通過基因干擾大鼠海馬Nrdpl的表達，在 載體水平探討Nrdpl對老年大鼠CPB后POCD的影響及其發(fā)揮作用的 調控機制是否與Nrdpl泛素化降解底物蛋白ErbB3及下游AKT信號通 路，促進神經元凋亡有關。
方法：
第1部分
選取18月齡SD (Sprague-Dawley，SD)雄性大鼠60只，按照隨 機數(shù)字表法分為三組（n=20)，即對照組（C組)、假手術組（S組)、 模型組（M組）。建模前對老年大鼠進行為期5天的行為學基線測試及 Morris水迷宮訓練。C組做為空白對照組，S組大鼠只做對應的血管結 扎，而未進行CPB，M組為CPB組。通過Morris水迷宮實驗觀察三 組老年大鼠術后第1、3、7天行為學的改變，包括1.定位巡航實驗（測
量逃逸潛伏期和游泳速度)、2.空間探索實驗（測量停留時間百分比和 停留路程百分比），以評價CPB對學習、記憶功能的影響。造模結束 后，通過使用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)檢測C、S、M三組大鼠在CPB后第1、3、7天海馬組織中炎 因子TNF-a、IL-lp的含量。用Westem-blot實驗方法檢測C、S、M三 組大鼠CPB后海馬組織中Nrdpl、ErbB3、p-AKT、C.Caspase3的表達 水平。通過 TUNEL 染色法（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL)，分別觀察 C、S、M 三組大鼠海馬 CA1、 CA3、DG區(qū)的神經元凋亡情況，并計算其凋亡指數(shù)。
第二部分
體外培養(yǎng)海馬原代神經元細胞，采用重組克隆技術，在細胞培養(yǎng) 的第5天將慢病毒轉染到培養(yǎng)所得的海馬原代神經元，構建特異性 Nrdpl過表達組、特異性Nrdpl沉默組以及空載質粒組海馬神經元。慢 病毒轉染72小時后構建細胞缺氧復氧模型，將海馬原代神經元按照隨 機數(shù)字表法分為5組：空白對照組（C組)、缺氧復氧組（H/R組)、空 載質粒缺氧復氧組(H/R+NC組)、Nrdpl過表達缺氧復氧組(H/R+Nrdpl 組）、Nrdpl 沉默缺氧復氧組(H/R+shNrdpl 組）〇Westernblot檢測Nrdpl、 ErbB3、p-AKT、AKT和C.Caspase3蛋白的變化情況。采用MTT法檢 測神經元的活性。流式細胞儀檢測神經元的凋亡情況。
第三部分
選取18月齡SD雄性大鼠60只。15只大鼠進行預實驗，通過顱 腦定位儀將慢病注射大鼠海馬CA1區(qū)，構建空載質粒、Nrdpl 過表達及沉默大鼠。剩余45只大鼠實施CPB手術，隨機分為5 組（n=9):空白對照組（C組）、體外循環(huán)組（M組)、空載質粒體外 循環(huán)組（M+NC組)、Nrdpl過表達體外循環(huán)組（M+Nrdpl組)、Nrdpl 沉默體外循環(huán)組（M+shNrdpl組)。通過Morris水迷宮實驗觀察五組老 年大鼠術后行為學的改變，包括1.定位巡航實驗、2.空間探索實驗，以 評價CPB對學習、記憶功能的影響。TUNEL熒光染色，觀察各組大 鼠海馬CA1區(qū)的海馬神經元凋亡情況。Western blot實驗方法檢測五組 大鼠在 CPB 后海馬組織中 Nrdpl、ErbB3、p-AKT、AKT 和 C.Caspase3 蛋白的變化情況。
